本文是一片来自网络的关于荧光显微镜日常操作文章，作者：崔泽实 郭德伦
在荧光显微镜观测时 , 镜像模糊、荧光暗弱、亮度不均、拍摄记录条件难以控制等是困扰实验者的常见问题。除荧光标本的制备环节外 , 掌握仪器的基本原理 , 合理配置、正确使用、必要的实时调试也是非常重要的 , 本文拟对后者略谈工作体会。 荧光显微镜是利用特定波长的光照射被检物体产生荧光进行镜检的显微光学观测技术 , 已有 100 多年历史。近年来 , 由于免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用 , FISH、绿色荧光蛋白 ( GFP) 技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广 , 显微照相、数字 CCD 成像技术的辅助驱动 , 赋予这一传统技术更新的应用价值和生命力。
1 基本原理
荧光: 是一种非温度辐射冷光 , 据发生性质可分为光化荧光 (由特定光源光谱激发而产生的荧光) 、放射荧光 (放射性物质激发) 、生物荧光 (生物体发出) 、化学荧光 (如磷氧化时) 等。荧光现象: 某物质在受到某种特定波长的高能量光 (短波长) 照射后获取能量 , 几乎即时 (约在 10～15 s 后) 其分子内的电子跃迁到较高能级轨道使分子进入激发态 , 激发态的分子不通过内部转换方式消耗能量回到基态 , 而是释放出相应较低能量的光量子→人眼可见的荧光 (较长波长) 。荧光现象有两种:一次荧光现象 , 又称"固有荧光"或"自发荧光", 是指经照射后 , 就能发出荧光的物质 , 此类物质的化学特征是发光分子具有共轭双键 , π电子活动性大。
二次荧光现象 , 又称"继发荧光", 物质经照射后不能或只能部分发生微弱的荧光 , 这样就需先用荧光色素 (或称荧光染料、荧光探针) 标记处理 , 将荧光色素标记结合插入到不发光的活性分子中去 , 再经照射才能发生荧光。荧光色素应具备的基本条件是能与不发光分子的某个区域有特异性的牢固结合 , 同时不会影响被结合分子的结构和特性 , 光量子效率应≥013。
荧光 的 产 生 包 含 了 激 发 ( Excitation) 和 发 射(Emission)两个过程 , 激发光谱短于发射光谱 , 故光色不同。而不同的荧光物质或荧光色素有其最敏感而有效的激发波长 , 因此选择合适的激发/ 发射光谱以获得最佳的荧光镜像质量是实验中要首先考虑的。荧光显微镜是利用"光化荧光"成像 , 如果所选激发波长在肉眼所看不见的近紫外光区 ( 320～400 nm) , 荧光的发射光谱也较普通光镜光源的平均波长短 , 光学分辨率提高。
2 荧光显微镜装置
近代荧光显微镜多是在复式显微镜的架构上安装荧光装置集合而成 , 荧光装置包括荧光光源、激发光光路、激发/ 发射滤光片组件等器件。荧光光源: 提供特定激发光波长范围及其光效能量的光源 , 以保证检测样品得到足够的激发而发出强的荧光。一般荧光显微镜多采用汞灯做光源 , 能够在常用激发光波长范围内提供不连续的光谱 , 在几处常用的光谱线 (365、405、449、550、600 nm) 表现有较强的光效能;如果荧光仅限于可见光范围内激发(如免疫荧光常用的 FITC ,436～490nm) ,也可考虑采用卤素灯光源;如追求紫外光激发效能的连续稳定性也可采取带状光谱特征的氙灯光源(细胞内 Ca+ +测定) 。在光源灯箱外侧装有 2～3 个灯丝对中心调整镙杆。荧光共焦显微镜则是用激光器经光纤导光做光源。荧光光光路: 或称荧光照明器 , 主要部件是一组聚光透镜 , 装有光路对焦调节; 在光路中还设有孔径光阑和视场光阑调节器件、ND 滤光片插槽 (板) 、激发光分光或处理镜件等。
激发/ 发射滤光片组件: 是一组具有一定通带宽度、带通 , 把激发/ 发射光谱选择性地限定在某一特定波宽内或带通的光学滤镜器件。目前多数厂家是把激发和发射光滤光片组合在一个立方体状结构里 , 安装在多位盘状转换器上调置于激发/ 发射光路中 (物镜与目镜间的镜筒) , 在两光路的垂直位成 45°角置一片称之为双色分光镜 (Dichroic Beamsplitter) 的滤光片选择性的透过或截止激发光和发射光。依据荧光样品的激发和发射光谱不同生产有不同宽窄带宽、长短带通组合的激发/ 发射滤光片组件 , 例如 EX470/ 40 或EX480/ 20 , 则 表 示 激 发 光 谱 是 在 中 心 波 长470 nm ±20 nm之间或 480 nm ±10 nm 之间 , EM522/ 40或 EM500 , 表示发射光谱在 522 nm ±20 nm 之间或≥500 nm (长发射通带) 。
荧光显微镜装置有透射式和落射式两种类型。近代荧光显微镜多采用落射式 , 即激发光是从物镜照射到样品 , 样品受激发后发出的发射光再经物镜聚光投射到观测光路 , 操作简单、视场均匀、高倍明亮、低倍暗。落射式荧光装置光路 , 见图 1。激发光从进入经物镜照射到标本上产生的荧光再反射给物镜观察 , 适于透明及非透明标本。
3 功能配置
要根据对显微荧光观测技术的实际需求 , 考虑以下因素 , 配置相应的功能附件。
1) 荧光照明器
个别厂家的荧光光源收光镜在质量上有消色差和复消色差两种 , 前者可满足常规工作 , 特殊研究可选后者。如果观测样品荧光亮度强 , 可选配适当透过率的 ND 滤光片。
2) 激发/ 发射滤光片组件
理论上应当针对拟使用的荧光色素或样品的荧光特性选择对应波谱的激发/ 发射荧光组件 , 做到合理搭配 , 但由于组件的种类繁多且价格较贵 , 一般常配宽带/ 长通滤光片组件。如果实验条件明确 , 则可以选择窄带/ 短通组件 , 如 GFP、FISH 观察。当然还有多波长组合 , 同时观测多个荧光光谱。除荧光显微镜生产厂家外 , 还可以向专门生产激发/ 发射滤光片的厂家 (如 , Chroma , Omega 等) 订购。常用荧光激发/ 发射组件及其适用的荧光色素见表 1。
3) 物镜
临床检验中有使用平场消色差物镜的情形 , 但若经常做 UV 激发会造成镜头老化 , 且会产生自发荧光。为达到较好的荧光观察效果 , 应考虑配置:
(1) 用无荧光氟石或萤石玻璃制成不会受激发产生自发荧光的落射荧光专用物镜。
(2) 如果用一个物镜兼顾荧光与透射相差成像 ,物镜级别一定要高 , 但因此种物镜的后焦面装有相位板会影响荧光成像效果 , 观测荧光较弱的样品最好要另配常用倍率的荧光专用物镜。
(3) 数值孔径尽量大 , 以获得较好的镜像亮度(亮度 = NA 物镜/ 放大倍率) 和分辨率。
(4) 要充分考虑待测样品的工作距离 , 对 40 ×以上物镜 , 如果载片较厚或是用倒置荧光观察培养器皿 , 应选择长工作距离的物镜且最好装有覆盖差校正环。
(5) 带数值孔径调节环的 100 ×油浸物镜。
(6) 用 FURA2 标记做细胞内 Ca+ + 测定或其他UV 激发 , 最好选用 UV 专用物镜。
4) 显微镜如用落射荧光仅是做常规荧光镜检 , 对显微镜就不一定追求高功率的透射光光源 , 6 V 30 W 卤素灯也可。但如果经常需要配合透射光观察 (如相差、DIC
等) 和兼做明场显微照相的情况下 , 则最好选择12V100W卤素灯光源机型; 相应周到考虑聚光镜的配置(如相差聚光镜) , 有条件最好选择兼顾明场、暗场、相差、DIC等功能的通用聚光镜。还要充分照应到荧光照相、数字 CCD 相机的接口适配能力。
5) 显微照相装置
要求应当是自动机型但有手动控制功能 , 另需具备 011 %或 1 %点测光和设有专用于荧光照相的拍摄模式 , 因荧光镜像的背景或物像较暗 , 最好配置有照明调焦调焦标线的取景放大镜 , 以利于调焦。
6) 数字 CCD 相机
数字 CCD 成像技术发展甚快 , 与显微镜配套使用的数字 CCD 相机种类较多。追求分辨率固然重要 ,但若获取好的显微荧光成像质量 , 还要考虑 CCD 的成像方式、灵敏度、成像速度、芯片对所用荧光素发射波长的量子利用效率等技术参数。满足一般荧光成像应采用科学级芯片 , 最好是冷 CCD , 以消除荧光成像遇到的暗流 (Dark Current) 干扰。
4 应用要点
1) 预检查和调节
(1) 在每次进行荧光观测前 , 必须例行检查荧光装置的灯丝对中、光路对焦、孔径光阑、视场光阑设置等状况。
(2) 所需要的荧光激发/ 发射滤光片组件是否已装在转换器中 , 物镜配置是否得当 , 除去物镜前透镜的油渍和灰尘。
(3) 如同时进行透射光相差观察 , 要检查聚光镜对中心及相差环与物镜相反的共轭情况。
(4) 检查样品载体 (载玻片、盖玻片和其他器皿) 有否挂有液体、灰尘 , 厚度是否在物镜标定的工作距离范围内。切片样品不能太厚 , 约 ≤10μm为宜。
(5) 因照明光源含有紫外线 , 在载物台前上方放一块棕色遮光板 , 以防紫外线损伤视网膜。
(6) 电压不稳会降低高压汞灯的使用寿命 , 光源电源最好加配稳压器。
(7) 为延长汞灯寿命 , 在开启后 15 min 方可关闭; 汞灯荧光电源一旦关闭 , 再次启动至少需等待10min , 以使水银蒸汽冷却复至原态 , 否则会影响灯的寿命。
2) 荧光镜像观察
(1) 在开启荧光灯源后约 5～10 min 激发光强度趋于稳定 , 装载样品进行观察; 为防止在调焦和寻找物像过程中过度激发光照会造成样品荧光淬灭 , 最好先通过缩小荧光照明器的孔径光阑或加 ND 滤光片将激发光调节到适度强度 , 有规律地移动样品台 , 待确定镜像后 , 在调节到最佳荧光状态用于拍摄记录。
(2) 镜像质量不佳的调整。排除样品制备因素外 , 可进行的必要调节措施是: ①排除成像光路中的遮光或限光器件 , 如 DIC 附件、ND 滤光片等。②重新调节荧光照明器的收光器对焦和孔径光阑大小。③细心调节物镜覆盖差校正环。④复查荧光激发/ 发射组件是否与所标记的荧光色素对应。
(3) 在不影响分辨率的前提下 , 于照相取景框和CCD 靶面范围之外 , 可尽量回缩荧光光路视场光阑和物镜 (100X 物镜) 的数值孔径光阑调节环 , 以避免杂散光的影响、提高景深 , 并可减小激发面积防止附加样品淬灭。
(4) 暂时不观察时 , 应阻断激发光路。
(5) 油镜观察时 , 须用"无荧光油", 尤其是在U、V 激发时 , 因常规镜检用的香柏油带有青色荧光。
3) 荧光照相和数字 CCD 相机图像采集
(1) 荧光照相
①尽管肉眼观察荧光镜像亮度与普通明场相差无几 , 而实际上曝光时间要增加数倍甚至几十倍 , 应使用 快 速 感 光 胶 片 , 如 ISO200 ( 24DIN ) 、ISO400(27DIN) 。②根据荧光物像在测光区的分布比例和镜像的明暗程度设置曝光补偿调节 , 原则上适当增大补偿 , 以获得背景黑暗荧光图像明亮、鲜艳的照片效果。③如果没有照明标线取景器 , 可先选择较明亮的荧光区域进行对焦调整。④对点状荧光物像或扑捉某点为主的拍摄 , 可选择适当的点测光模式。⑤对在同一幅需要同样条件拍摄的分散点状荧光物像 , 可试用点测光配合自动锁定方式拍摄。⑥曝光过程应避免任何振动 , 有条件可配置防震台。
(2) 数字 CCD 相机图像采集
①光学接口的中间倍率要与 CCD 的芯片尺寸合理匹配。②采用合适的荧光拍摄模式 , 摸索减背景(Background Subtraction) 处理条件 , 根据镜像情况设置 Binning、Gain、Gamma 等参数。 ③因 CCD 芯片灵敏度较高 , 如果荧光镜像过于明亮 , 为获取对比度较好的采集图像 , 可适当缩小荧光照明器孔径光阑或加ND 滤光片 , 特别是在荧光辉光较强影响拍摄样品细节的情况时。实际工作中 ,为获得较好的荧光图像拍摄质量需要对上述调节机制的综合运用 ,反复摸索、优化条件。
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